- Abbiamo ritenuto utile procedere a riunire in un unico contesto i lavori sinora pubblicati sul Metodo Di Bella da riviste scientifiche internazionali, compreso quello sui tumori polmonari del quale avevamo dato notizia in nostra precedente discussione.
- L`esposizione è seguita da un elenco di molti dei principali principi attivi impiegati nel Mdb ai quali sono accostati richiami a diversi lavori, recenti e meno recenti, apparsi su riviste scientifiche in tutto il mondo ed attestanti l`attività antitumorale delle componenti Mdb.
- Infine troverete il testo di lavori, o di abstracts di comunicazioni del Prof. Luigi Di Bella in congressi nazionali e internazionali riguardanti la sua ricerca - in campo oncologico od ematologico - dal 1969. I lavori sono riportati in ordine cronologico.
Tutti i testi pubblicati sono coperti da copyright.

Riteniamo che questa iniziativa consentirà, in modo semplice e senza obbligare a ricerche complesse e dispendiose, di farsi un`autonoma convinzione sul Mdb. Potranno usufruirne sia i pazienti più attenti che desiderino ampliare le loro conoscenze, sia medici onesti - siano essi medici di base o ospedalieri con i quali i pazienti siano venuti in contatto - che avranno così modo di rendersi conto di persona delle tante pretestuosità e falsità diffuse sul Metodo Di Bella.

6) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals

Somatostatin, Retinoids, Melatonin, Vitamin D, Bromocriptine, and Cyclophosphamide in Chemotherapy-Pretreated Patients with Advanced Lung Adenocarcinoma and Low Performance StatusFeb 2007, Vol. 22, No. 1 : 50 -55 
Achille Norsa Division of Thoracic Surgery, Ospedale Maggiore Azienda Ospedaliera, Verona, ItalyVincenzo Martino Società Italiana di Bioterapia Oncologica Razionale, Bologna,

ItalyBackground: We previously reported on an improvement in survival and quality of life in chemotherapy-naïve patients with advanced non-small-cell lung cancer and low performance status (PS) treated with a combination of biotherapeutical agents and cyclophosphamide. In this study, we assessed the survival, clinical status, and toxicity of this multidrug regimen in chemotherapy-pretreated patients with advanced lung adenocarcinoma and low PS. Methods: Patients with stage IIIB or IV lung adenocarcinoma, who had progressed after prior standard chemotherapy, and with an Eastern Cooperative Oncology Group PS ≥ 2, received a daily combination of somatostatin, retinoids, melatonin, vitamin D, bromocriptine, and cyclophosphamide. Results: Twenty-three (23) patients were enrolled. The median age was 59 years (range, 42–75). The PS was 2 and 3 in 73.9% and 26.1% of patients, respectively. The median overall survival (intent-to-treat analysis) was 95 days (range, 19–214). The side-effects were mild, mostly consisting of diarrhea, nausea and vomiting, and drowsiness of Grade 1–2. There was an improvement in both respiratory and general symptoms, which was more evident in patients surviving more than 95 days. Conclusions: The combined regimen of somatostatin, retinoids, melatonin, vitamin D, bromocriptine, and cyclophosphamide is well tolerated and can improve disease-related symptoms in heavily pretreated patients with late-stage lung adenocarcinoma and poor PS. 

7) Neuro Endocrinol Lett. 2008 Dec 29;29(6).

"Complete objective response to biological therapy of plurifocal breast carcinoma".
Di Bella GD. Di Bella Foundation, Bologna, Italy. posta@giuseppedibella.it.

Traduzione

Nel caso in questione, una donna affetta da carcinoma mammario che aveva scelto di praticare la terapia biologica del Prof. Luigi Di Bella (MDB), ha fatto riscontrare, dopo sette mesi di cura, una riduzione del 50% delle dimensioni del suo carcinoma, e la guarigione totale dopo 14 mesi di cura.

La malattia della paziente, che si era presentata anche con adenopatie ascellari, è scomparsa senza dover subire la tossicità associata usualmente ai trattamenti oncologici. Il Metodo Di Bella contempla l'uso di molecole antiproliferative, come somatostatina, inibitori della prolattina e degli estrogeni, associate ad altre molecole pro-differenzianti e pro-apoptotiche come melatonina, retinoidi, vitamine C, D3 ed E, calcio e amino-zuccheri associati a microdosi di antiblastici. Gli esami ematochimici non hanno evidenziato alcun effetto collaterale, con una progressiva riduzione dei livelli di prolattina, estrogeni, IGF1 e un costante basso livello del GH. Il conseguimento di risultati obiettivi senza alcuna tossicità, dimostra nel caso esposto l'efficacia di questa terapia, ad ulteriore conferma dei risultati già pubblicati, e relativi all'adozione del MDB nei linfomi n.H. di basso grado e nei carcinomi polmonari al III° e IV° stadio. Il Metodo Di Bella, senza la necessità di alcun ricovero ospedaliero e nemmeno di alcun day hospital, senza alcuna tossicità e senza incidere minimamente sulle giornaliere abitudini lavorative della paziente, ha permesso di evitare il trauma dell'intervento chirurgico ed i rilevanti effetti collaterali della chemio e della radioterapia. L'opportuno ricorso al MDB come terapia di prima linea, in una paziente che non era stata debilitata dagli effetti mutageni, tossici ed immuno-depressivi propri della chemio e della radioterapia, è stato determinante per il raggiungimento del risultato finale. Noi riteniamo utile sottolineare l'importanza di questo caso per incentivare l'interesse ad uno studio approfondito del potenziale terapeutico di una terapia biologica e recettoriale come il Metodo Di Bella.

Testo originale

1: Neuro Endocrinol Lett. 2008 Dec 29;29(6). [Epub ahead of print]

Complete objective response to biological therapy of plurifocal breast carcinoma.Di Bella GD.

Di Bella Foundation, Bologna, Italy. posta@giuseppedibella.it.

In this case presentation, a woman with breast carcinoma who chose to try Prof. L. DiBella's biological therapy (MDB), was found, after seven months, to have a 50% reduction in objective measures of her carcinoma and was totally cured after 14 months. The patient's recovery extended to bilateral axillary adenopathies, and took place without the toxicity normally associated with cancer treatment. MDB entails the use of anti-proliferative molecules such as somatostatine, prolactin, and estrogen inhibitors, along with differentiating and apoptotic molecules such as melatonin, retinoids, vitamins C, D3, and E, calcium, and amino-sugars, combined with minimal doses of chemotherapy. The hemato-chemical exams showed no damage, with a progressive reduction of prolactin, estradiol, IGF1, and maintenance of low levels of GH. The achievement of objective results, without toxicity, in this case, proves the effectiveness of this therapy and confirms the positive results already published on the use of MDB for Low-Grade NHL, and pulmonary carcinomas in the 3rd and 4th stages. MDB, without the need for either hospitalization or day hospitalization, without toxicity, and without even minimally reducing the patient's daily work routine, allowed the patient to avoid surgical trauma and the significant collateral effects of chemo- and radiotherapy. Timely use of MDB as the first line therapy, in a patient which had not been debilitated by the mutagenic, toxic, and immuno-depressive effects of chemo- and radiotherapy, contributed greatly to the final outcome. We feel it is useful to highlight this case in an effort to stimulate interest and further study into the oncological potential of MDB biological and receptor therapy.
 
8)

Il libro del Dr. Giuseppe Di Bella

1)
Pubblicazione Quindicinale - Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. XLV  Numero 20bis Ottobre 1969 - Sotto l'auspicio del Consiglio Nazionale delle Ricerche.

La stimolazione dei nuclei epitalamici induce nel ratto aumento significativo del tasso piastrinemico, senza contemporanea modificazione significativa degli elementi della serie rossa e bianca. Gli effetti sono diversi per la stimolazione di altri distretti encefalici. Siccome gli effetti rilevanti avrebbero potuto essere mediati dalla melatonina gli AA. hanno studiato gli effetti della iniezione e.v. e intraventricolare della sostanza nei conigli, ottenendo aumento significativo delle piastrine e diminuzione degli eritrociti e dei leucociti, la quale ultima si svolge soprattutto a carico di granulociti. L'aumento delle piastrine la melatonina i.p. non lo provoca nei ratti, nei quali invece riesce attiva la 5'-metionin-adenosina. Sospensioni di liofilizzazione di epifisi e di epitalami non sembrano modificare gli effetti dell'iniezione i.p. nei ratti della miscela di melatonina e 5'-metionin-adenosina.

Estratto dal Vol. 69, 1972, fasc. 1"

Lancellotti L., I. Zini, L. Di Bella e M.T. Rossi (Istituto di Fisiologia umana, Cattedra di Fisiologia generale della Università di Modena).
Dinamica midollare dopo trattamento subacuto e cronico con melatonina.

 

Aumento transitorio del tasso piastrinemico l'abbiamo ottenuto nei ratti per stimolazione delle abenule [1], e non di altre zone telencefalodiencefaliche rostro-ventrali; frequentemente in questo ultimo caso si può avere effetto leucopenizzante, e specificamente linfopenizzante. Ci parve interessante studiare l'effetto della melatonina sulla dinamica midollare.

Abbiamo all'uopo iniettato i.p. nei ratti, alla dose di µg 200/100 g p.c., la melatonina (soluzione in etanolo acquoso 2%). Dopo 10-129 iniezioni (una al dì) in 10 ratti diversi si trovò un peso medio del midollo delle ossa lunghe (omeri, femori, tibie) di mg 215,78±52,6, corrispondente a mg 0,62±0,25/g p.c., pari a quello di animali non trattati. La % di acqua fu del 74,04±3,6.

Il no. di elementi cellulari fu 1.323.000±705.000/mg di midollo, corrispondente in media a 820.10³±476.10³ elementi/g p.c.

Calcolando pari a 1/20 del peso corporeo la massa totale di sangue, il no. degli elementi corpuscolari circolanti sarebbe stato di 13,54.10¹⁰±2.10¹⁰ eritrociti, 274.10⁶±125.10⁶leucociti, 25,2.10⁹±14,3.10⁹ piastrine. Il no. di eritrociti+granulociti circolanti risulta perciò di alcune centinaia di volte maggiore del no. degli elementi del midollo estratto dalle ossa lunghe.

Poiché il midollo totale pesa circa dieci volte più di quello delle ossa lunghe [2], e gli elementi della serie rossa e bianca rappresentano solo una parte della cellularità del midollo, se ne può concludere che per 20-40 eritrociti+granulociti circolanti vi è un elemento cellulare del midollo, e cifre perfettamente sovrapponibili a queste abbiamo trovato in animali normali controllo, ugualmente iniettati i.p. con soluzione etanolica 2%.

Il rapporto eritrociti+granulociti circolanti/elementi del midollo tende ad aumentare col crescere del no. delle iniezioni di melatonina, fino ad un massimo di 24 iniezioni, per poi gradualmente declinare fino ai valori di partenza.

3)
Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale
Vol. XLVIII, n. 20 bis - 31 ottobre 1972

I. Zini, Luigi Di Bella, M.T. Rossi, P. Sorgato

Effetti della perfusione melatoninica sulla differenza artero-venosa del compartimento cellulare del sangue circolante nei ratti splenectomizzati.

Ci siamo occupati altrove degli effetti della melatonina sul sangue circolante di ratti normali. Nel presente studio abbiamo seguito le differenze artero-venose dopo plenectomia, negli animali perfusi con Melatonina (μ1,09÷1,17/gr/h), sciolta in etanolo acquoso 2%, o con solo solvente. La splenectomia inverte in genere le differenze artero-venose del numero dei G.R., rilevate prima dell'intervento, e la per fusione con etanolo non modifica questo effetto, che può essere invertito o aumentato dalla melatonina.

La differenza veno-arteriosa del valore ematocritico non viene invece modificata nei 3-4 gg che seguono la splenectomia, e neanche dalla successiva infusione con soluzione di melatonina o di solo solvente. La splenectomia non incide invece sulla differenza veno-arteriosa dei G.B. nella maggior parte dei casi, così come l'infusione di melatonina o del solo solvente. Altrettanto può ripetersi per gli elementi non granulocitici.

Le piastrine in genere aumentano di numero, tuttavia si riducono nel contempo di tanto le dimensioni da rendere difficile o impossibile una conta esatta e l'accertamento di una eventuale differenza veno-arteriosa; la melatonina sembra essere in grado di far aumentare il tasso piastrinemico nel sangue arterioso, dopo splenectomia, effetto non rilevato con etanolo.

4)

I. Zini, L. Di Bella, M.T. Rossi e L. Lancellotti (Istituto di Fisiologia umana, Cattedra di Fisiologia generale della Università di Modena).

Poiché solo il sistema abenulo-epifisario, stimolato, pare sia in grado di far aumentare transitoriamente il tasso delle piastrine circolanti [1], mentre l'iniezione i.p. di melatonina, anche se ripetuta per lunghi periodi, non sembra in grado di modificare la piastrinemia, abbiamo ritenuto interessante studiare gli effetti della iniezione di melatonina sul sistema piastrinopoietico megacariocitario del midollo osseo.

A tale scopo, un frammento della mescolanza omogenea dei sei midolli ottenuti dagli omeri, femori e tibie di ratto, veniva strisciato su un vetrino pesato a meno di mg 0,005 prima e dopo lo striscio e la quantità di midollo secco strisciata, calcolata per differenza. Dopo colorazione pancromatica si contavano tutti i megacariociti dello striscio, e dal no. conteggiato si risaliva al no. presente in 1 mg di midollo fresco, attraverso il peso del midollo strisciato e la sua % di acqua.

Poiché la melatonina si iniettava i.p. in soluzione etanolica al 2%, si è dovuto saggiare in ratti controllo l'effetto della sola soluzione acquosa in etanolo, e i risultati sono stati posti a confronto con quelli di un 3° gruppo di ratti non trattati. Il no. di megacariociti è stato di 1235,7±455,8/mg nei ratti normali, di 1185±751,4/mg in quelli trattati con etanolo, di 973±830,7/mg nei ratti trattati con melatonina. Come si vede il trattamento subacuto e cronico i.p. con melatonina fa ridurre il no. dei megacariociti del midollo delle ossa lunghe, ma non significativamente.

La riduzione del no. dei megacariociti del midollo potrebbe farsi risalire ad un'accentuata piastrinopoiesi; poiché detta diminuzione non è significativa, né la melatonina riesce in tutti i casi a provocare l'aumento della attività piastrinopoietica dei megacariociti e/o agire sui meccanismi di immissione in circolo delle piastrine.

I dati da noi rilevati sembrano comunque indicare un'azione bifasica della melatonina; una prima fase, compresa entro i primi 20-30 giorni, durante la quale il no. dei megacariociti tende a calare, una seconda fase, nella quale probabilmente altri fattori a feed-back si possono sovrapporre alla azione della melatonina, mascherandone eventualmente gli effetti e nella quale i megacariociti tenderebbero a riportarsi ai valori normali. Non si è misurato il diametro dei megacariociti [2].

BIBLIOGRAFIA

[1] Di Bella L. et alii - Boll. Soc. it. Biol. sper., 1969, 45, comunic. 171.

[2] Harker L.A. - Formation and Destruction of Blood Cells. Lippincott, Phyladelphia, 1970, p. 173/segg.

5)

L. Di Bella, M.T. Rossi, L. Lancellotti e I. Zini (Istituto di Fisiologia umana, Cattedra di Fisiologia generale della Università di Modena).

Lo studio microscopico del midollo osseo di ratti, in condizioni diverse ci ha svelato frequente l'esistenza di grandi neutrofili dentro i megacariociti, fino in numero di 16 in qualche caso, reperto difficilmente interpretabile come fagocitosi; in diversi megacariociti d'altra parte si è creduto interpretare a favore di una origine endomegacariocitica dei neutrofili, alcune immagini.

Nello stesso senso depone la frequente vicinanza dei grandi neutrofili ai megacariociti del midollo normale, simile alla emperipolesi e alla peripolesi linfatica nella leucemia linfoide [1, pag. 151].

Parlano altresì a favore di particolari rapporti fra neutrofili e megacariociti: 1) l'invasione neutrofila dei megacarioblasti dopo trattamento col siero antipiastrinico [1, pag. 155], 2) il difetto simultaneo di membrana nell'Hb-uria notturna parossistica, negli eritrociti, nei grandi neutrofili e nelle piastrine [1, pag. 242], la cui membrana deriva da quella dei megacariociti [2, pag. 46 segg.]; 3) la possibile evoluzione della mielosi megacariocitica in leucemia cronica granulocitica e presenza del cromosoma Ph [3]; 4) la frequente associazione della trombocitemia con la leucocitosi granulocitica ed il satellismo delle piastrine verso i neutrofili [4, pag. 140].

Dopo iniezione lenta (µg 0,293/100 g/min) di melatonina nella v. cava inf. di ratti incannulati a permanenza non varia significativamente il tasso piastrinemico, mentre le variazioni possono essere sensibili dopo iniezione più rapida; anche in queste condizioni varia nel contempo il tasso dei neutrofili circolanti.

La melatonina sembra intervenire oltre che nei rapporti fra piastrinopoiesi e neutropoiesi, anche nella regolazione a feed back del tasso piastrinemico e possibilmente anche nella costituzione o nel meccanismo d'azione della trombopoietina {1, pag. 128 segg.].

[1] Rebuck, Abraham and Short - In: Formation and destruction of blood cells. Lippincott, 1970.

[2] White - In:The circulating platelet. Acad. Press, 1971.

[3] Woodliff H.J. = Leukaemia cytogenetics. Lloyd-Luke, London, 1971.

[4] McDonald, Dodds and Cruickshank - Atlas of hematology, Livingstone 1970, 3^a ed. 

BIBLIOGRAFIA

Proceedings of the International Union of the Physiological Sciences. Vol. XI. XXVI International Congress. New Delhi, 1974. Abstracts of volunteer papers.

Nervous control of thrombocytopoiesis.

The electric stimulation (square waves, 50 Hz, 2-12 V, implanted electroides) of epithalamic habenular nuclei induces a significant rise of bllod platelets, after a lag time of 24-32 hours. The blood platelets elevation lasts no longer than 72 hours, and then declines to preceding values. No other district of rat brain, equally stimulated, promotes a similar elevation of blood platelets. Neither melatonin nor 5'-methionin-adenosine are able to mimic the effects of habenular stimulation. Several factors may be responsible of this effect diversity; the most important are:
1) the permeability of bone marrow to melatonin;
2) the reactivity of megacaryocites to melatonin;
3)the sequestration of blood platelets and leucocytes in the pulmunary capillary bed.
In many human subjects, both in good health and affected by thrombocytopenia, melatonin by mouth may promote a temporary, but significant rise of blood platelets. It is probable that other central nervous or peripheral humoral mechanisms partecipate well to blood leucocytes multiple equilibrium reactions.

9)

Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale. Vol. L, n. 20 bis - ottobre 1974

Il plasma umano normale (SPECTOR: Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1961, 108, 146) e quello di soggetti trombocitopenici (ABILDGAARD & SIMONE: Sem. Hemat., 1967, 4, 424; SPECTOR, l.c.; ODELL e Coll. Proc. Soc. Exp Biol. Med., 1961, 108, 428; DE GABRIELE & PENINGTON: Brit. J. Hematol., 1967, 13, 210; SCHULMAN e Coll.: J. Pediatr., 1965, 66, 604) stimola la trombocitopoiesi (EVATT & LEVIN: J. Clin. Invest., 1969, 481615; PENINGTON: Brit. Med. J., 1970, 1, 606). Il fattore umorale è stato ritenuto essere una glicoproteina (LINMAN & PIERRE: J. Lab. Clin. Med., 1963, 62, 374) o altre plasmaproteine (ABILDGAARD & SIMONE, L.C.; EVATT e Coll.: Blood. J. Hematol., 1972, 40, 926).

La trombocitosi post-transfusionale si tramuta al 5°-6° giorno in una "rebound thrombocytopenia" (ODELL e Coll.: Acta Haematol. , 1967, 38, 34; EVATT & LEVIN: J. Clin. Invest., 1969, 48, 1615), considerata espressione di ridotta piastrinopoiesi in quanto cala l'incorporazione nelle piastrine di 75Se-metionina e di Na235SO4 (SHREINER & LEVIN: J.Clin. Invest., 1970, 49, 1709; HARKER: Am. J. Physiol., 1970, 218, 1376). I megacariociti del midollo sono numerosi e più piccoli e i nuclei meno lobulati, soprattutto al 4° giorno della trombocitosi. Nel midollo di ratti normali iniettati e.v. con lisati piastrinici (l.p.) (v. note precedenti) abbiamo visto dopo 96 ore dall'iniezione singola: 1) che la serie eritroide (E) rappresenta in media il 13,28±7,805% di tutta la popolazione cellulare; che la stessa serie (E) è stata di 10,29±5,815% nei ratti iniettati e.v. con lisati piastrinici denaturati con il calore; di 13,106±3,441% nei ratti iniettati e.v. con plasma; e infine di 7,071±5,512% negli sham-operated.

Il lisato di piastrine non sembra quindi modificare significativamente dopo 96 ore dalla iniezione endovena la quota relativa della popolazione eritroide nel midollo. 2) I granulociti (Gr) hanno rappresentato il 23,215±7,825% nei ratti iniettati con l.p.; 19,419±6,816% nei ratti iniettati con l.p. denaturato; 18,512±4,915% nei ratti iniettati con plasma; 19,829±5,910% nei ratti sham-operated. Neanche sui granulociti maturi il l.p. ha manifestato effetti significativi. 3) Il rapporto E/Gr è stato di: 0,682±0,68 nei ratti iniettati con l.p.: 0,570±0,309 nei ratti iniettati con l.p. denaturato; 0,736±0,221% nei ratti iniettati con plasma; 0,379±0,235 nei sham operated. L'unica differenza significativa tra i predetti rapporti è quella fra i ratti iniettati con plasma e gli sham-operated sham-operated (0,001

 

14)

BOLLETTINO DELLA SOCIETÀ ITALIANA DI BIOLOGIA SPERIMENTALE

Vol. LI, N. 18 bis - 30 Ottobre 1975

Contributo alla natura delle interazioni tra nucleotidi e aril-amine nella fisiologia delle piastrine.

Numero di elementi e di megacariociti del midollo osseo di ratto.

19)

Archivio Italiano di Fisiologia (in sta, 98)

(CONGRESSO SOCIETÀ ITALIANA DI FISIOLOGIA - Firenze, 28-29 maggio 1976)

M.T. Rossi, G.P. Biral, Luigi Di Bella, R. Ferrari, I. Zini

(Istituto di Fisiologia, Cattedra di Fisiologia Generale dell'Università di Modena)

Studio di alcuni fattori del ricambio piastrinemico.

Dopo deplezione acuta delle piastrine circolanti il tasso piastrinemico riprende spontaneamente a salire ("rebound thrombocytosis") prima, a calare dopo ("rebound thrombocytopenia"), per cui si pensa esista un meccanismo di controllo umorale della piastrinopeisi.

Nei ratti esiste una differenza costante tra il tasso delle piastrine nel cangue arterioso e quello del sangue venoso che può oscillare da +11,47±7,8 a -16,6±11,76 ed è in media di -3,5±17. Un'ora dopo l'iniezione e.v. di 1 ml di soluzione fisiologica salina la differenza veno-arteriosa è di -38,6±28,7, significativamente più negativa rispetto agli animali controllo (P<0,001 per 45 G.L.). Dopo trasfusione di sospensioni piastriniche in soluzione salina, la differenza veno-arteriosa è di 0,38±17,08 (P=0,01).

Sembra che la diluizione del plasma con soluzione fisiologica salina promuova la liberazione/o la produzione nei tessuti di piastrine, fenomeni controbilanciati dall'iniezione e.v. di piastrine omologhe. Iniettanto e.v. plasma omologo, la differenza veno-arteriosa di piastrine è di +3,7±4,4: il comportamento del tasso piastrinemico è perciò significativamente (P<0,05) influenzato dal protidoplasma, che tende a far ridurre il ricambio di piastrine. Le piastrine omologhe trasfuse sono cedute (-) o trattenute (+) dal polmone secondo una funzione rettilinea della quantità totale di piastrine iniettate. La funzione ha coefficiente di correlazione alto (r=0,95) per il plasma ricco di piastrine, molto basso (r=0,27) per la sospensione di piastrine in soluzione fisiologica.

Si può concludere che: 1) le piastrine possono essere trattenute o liberate nei tessuti; 2) la soluzione fisiologica salina tende a rendere negativa la differenza veno-arteriosa; 3) questa tendenza può essere acutamente controbilanciata dalla trasfusione simultanea di sospensione di piastrine; 4) le proteine plasmatiche si oppongono efficaciemente all'eventuale fissazione delle piastrine nei tessuti.

20)

Archivio Italiano di Fisiologia (in sta, 98)

Luigi Di Bella, G. Scalera, M.T. Rossi e L. Gualano

(Istituto di Fisiologia Umana dell'Università di Modena)

Variazioni del 2,3-DPG eritrocitario dopo trattamento acuto con 5-metossi-n-acetil-triptamina (melatonina).

Dopo la scoperta del 2,3-DPG e delle sue ripercussioni sulla pO2 necessaria per avere il 50% di ossigenazione dell'Hb (P50) [1, 2], l'interesse si è spostato anche verso lo studio dei rapporti tra modificazioni della struttura dell'Hb da una parte e contenuto in 2,3-DPG degli eritrociti dall'altra [3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11].

Avendo noi rilevato da tempo che la somministrazione, a pazienti talassemici, di 5-metossi-N-acetil-triptamina (MLT) induce un miglioramento sensibile, e a volte drammatico, delle condizioni di ossigenazione e sanguificazione, abbiamo ritenuto utile indagare se l'effetto rilevato non fosse eventualmente riportabile ad aumento del tasso eritrocitario del 2,3-DPG.

La determinazione del 2,3-DPG è stata fatta col metodo di LOWRY e Coll. [12], modificato, adoperando lo spettrofotometro Beckman DK-2A. I ratti erano di razza Wistar, maschi, del peso medio di gr. 311,9±40,8, in narcosi da Na-pentobarbital (mg 60/kg i.p.); essi furono iniettati nella giugulare esterna con soluzione acquosa di MLT nella misura di 1 mg/kg. La soluzione era stata resa isotonica con aggiunta di urea; come ratti confronto furono adoperati quelli iniettati con soluzione di sola urea ugualmente concentrata e nella stessa quantità. Il sangue veniva prelevato dalla carotide con siringa siliconata ed eparinizzata, prima dell'iniezione di MLT, e dopo 60 e 150 minuti. Nei singoli prelievi si determinavano: globuli rossi; formula leucocitaria; Hb; ematocrito (Hcr); 2,3-DPG. Dopo l'ultimo prelievo gli animali venivano dissanguati; veniva prelevato il midollo dal femore e dalla tibia, che veniva strisciato, colorato e letto per ottenere il mielogramma. I risultati sono riportati nella Tabella 1.

Come era prevedibile, sia il tasso di Hb, che il numero di globuli rossi in conseguenza del dissanguamento parziale, sono calati sia negli animali non iniettati che in quelli trattati con MLT. È calato anche l'Hcr, mentre l'MCV ha mostrato tendenza a salire nei due gruppi di ratti. Il 2,3-DPG, riferito allo stesso volume di sangue, è calato nei due gruppi di ratti, e, in quelli trattati con MLT, significativamente più, (0.025 

Il libro scritto dal Dr. Giuseppe Di Bella

Il 2,3-DPG riferito all'MCV è calato sia nei ratti trattati che in quelli non trattati con MLT, nei primi più che nei secondi dopo 150 min (0.025

La percentuale dei linfociti nel sangue periferico è calata significativamente nei 2 gruppi di ratti fino a 60 min dall'inizio; solo nei ratti trattati con MLT però la diminuzione ha continuato fino alla fine; modificazioni opposte hanno mostrato i granulociti. Gli elementi della linea mieloide sono cresciuti relativamente nel midollo da 46.65±4.36 a 49.86±6.34% negli animali non trattati (0.05

Concludendo: il trattamento con MLT sembra far calare significativamente rispetto agli animali controllo il contenuto in 2,3-DPG riferito ad 1 globulo rosso. Tale diminuzione è probabilmente in rapporto con la diminuzione dell'MCV, che si avvera soltanto nei ratti trattati con MLT verso la fine dell'esperimento. È probabilmente agendo sul metabolismo dell'acqua dell'eritrocita e sulla mobilitazione dai depositi di eritrociti, che agisce acutamente la MLT. Il trattamento cronico contribuisce verosimilmente a spostare anche le varie componenti del mielogramma, promuovendo validamente l'eritropoiesi.

BIBLIOGRAFIA

[1] Benesch R., R.E. Benesch e Y. Enoki - Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 1968, 61, 1102.

[2] Chanutin A. e R.R. Curnisch - Arch. Biochem. Biophys., 1967, 121, 96.

[3] Bellingham A.J. e E.R. Huehns - Nature, 1968, 218, 924.

[4] Delivoria-Papadopoulos M., F.A. Oski e A.J. Gottlieb - Science, 1969, 165, 601.

[5] Tyuma I. e K. Shimizu - Fed. Proc., 1970, 29, 1112.

[6] Bunn H.F. e R.W. Briehl - J. Clin. Invest., 1970, 49, 1088.

[7] Charache S., S. Grisolia, A.J. Fiedler e A.E. Hellegers - J. Clin. Invest., 1970, 49, 806.

[8] Oski F.A., A.J. Gottlieb, W.W. Miller e M. Delivoira-Pâpadopoulos - J. Clin. Invest., 1970, 49, 400.

[9] Bauer C. - Resp. Physiol., 1970, 10, 10.

[10] Schettini F., A. Mautone e I. De Lucia - Boll. Soc. It. Sper., 1974, 50, 215.

[11] Bonaventura J., C. Bonaventura, B. Sullivan e G. Godette - J. Biol. Chem., 1975, 250, 9250.

[12] Lowry O.H., J.V. Passonneau, F.X. Hasselberg e D.W. Schulz - J. Biol. Chem., 1964, 239, 18.

21)

Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

Luigi Di Bella, M. Bucciarelli, U.M. Pagnoni, G. Scalera e M.T. Rossi (Istituto di Chimica Organica Cattedra di Fisiologia Generale dell'Università di Modena)

Formazione di complessi tra melatonina (mlt) e basi puriniche e pirimidiniche.

Dopo la scoperta della serotonina nelle piastrine (BRACCO e CURTI EXPERIENTIA, 1954, 10, 71), e la dimostrazione che la sostanza non è ivi formata ma solo trasportata e assunta elettivamente, BORN, INGRAM & STAVEY (Brit. J. Pharmacol. Chemother., 1958, 13, 62) ne dimostrarono rapporti molecolari con ATP, e BAKER, BLASCHKO & BORN (J. Physiol., London, 1959, 149, 55P) la presenza nei granuli, isolati in forma pura DA PRADA e Coll. (Nature, 1967, 216, 1315).

La formazione di tali complessi è stata studiata recentemente "in vitro" attraverso NMR, misurando la variazione dei "chemical shifts" dei protoni delle basi azotate dopo l'aggiunta di serotonina e derivati (HELENE e Coll.: Biochemistry, 1971), 10, 3802; Dimicoli e Coll.: Biochemie, 1971, 53, 331; Idem: J. Am. Chem. Soc., 1973, 95, 1036; WANG & LI: J. Am. Chem. Soc., 1968, 90, 5069).

La formazione di tali complessi è stata studiata "in vitro" attraverso misure di NMR e i risultati indicano che, in presenza di un eccesso di nucleotidi o nucleosidi, la serotonina può sostituire le basi azotate negli aggregati; le costanti di associazione dei complessi tra purine e derivati indolici sono dello stesso ordine di grandezza. Noi abbiamo studiato la formazione di complessi fra guanosina, adenosina, uridina e citidina da una parte e MLT dall'altra.

A causa della scarsa solulibilà della MLT abbiamo operato in forte eccesso di nucleoside. Le variazioni più significative dei "chemical shifts" sono state rilevate operando in Dol 1N, con concentrazioni 0.25M in base azotata e 0.01M in MLT. Esse risultano di entità inferiore a quelle riportate per gli altri derivati indolici probabilmente per la minore quantità relativa in MLT.

È tuttavia da rilevare che tali variazioni sono senz'altro sufficientemente significative nell'indicare una associazione MLT - nucleoside. In particolare nel caso dell'adenosina le variazioni dei "chemical shifts" sono a campi più bassi, indicando probabilmente aggregati a legami d'idrogeno (HELENE e Coll.: Biochim. Biophys. Acta, 1971, 254, 349), nel caso invece di guanosina, citidina e uridina le variazioni dei "chemical shifts" risultano verso campi più alti, potendo significare una aggregazione tipo "stacks".

22)

Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

G. Scalera, Luigi Di Bella, M.T. Rossi, L. Gualano e F. Vaccari (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale, Università di Modena)

Effetto dell'elettroforesi "in vivo" sul mielogramma di ratto.

Nel ratto in narcosi nembutalica si sono scoperte le due epifisi del corpo dei due femori, si sono forate con fresa sferica, e nei due fori si sono introdotti elettrodi di Ag/AgCl. I due elettrodi erano distanti 21.5-25 mm con anodo prossimale-catodo distale in uno, e anodo distale-catodo prossimale nell'altro.

La corrente continua si faceva passare per 180 minuti alla tensione di 80 mV e l'intensità di circa 0,5 µA. Tensione e corrente venivano registrate su poligrafo Sanborn mod. 150. La resistenza era di circa 36x104 Ohms e poteva variare entro modesti limiti. Alla fine dell'esperimento l'animale veniva dissanguato e col midollo delle estremità prossimale e distale del femore, nonchè con quello diafisario si allestivano gli strisci. I mastociti tendono a rarefarsi nella diafisi e ad addensarsi alle epifisi, verso l'anodo più che verso il catodo.

Si può avere in qualche caso una discreta significatività fra la densità all'anodo rispetto quella al catodo (0.10

Per gli elementi della serie monocitica, plasmocitica e megacariocita non si sono mai ottenuti risultati univoci. Gli elementi della serie eritroide hanno tendenza alla rarefazione verso il catodo. Il rapporto Miel/Er in alcune serie può raggiungere valori di P<0.001. È diverso perciò il comportamento dei vari elementi mantenuti in ambiente naturale e sottoposti a un campo elettrico.

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Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

G. Scalera, Luigi Di Bella, M.T. Rossi e L. Gualano (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale, Università di Modena).

Effetto della melatonina (MLT) sopra il 2,3-DPG degli eritrociti circolanti di ratto.

Dati gli effetti favorevoli sull'ossigenazione del sangue e dei tessuti dopo trattamento con melatonina (MLT), abbiamo indagato se cresceva nei globuli rossi il tasso di 2,3-DPG. Ratti di gr. 312±41 in narcosi nembutalica sono stati iniettati con MLT e.v. (mg. 1/Kg), ed il 2,3-DPG degli eritrociti determinato col metodo di LOWRIE e Coll. (J. Biol. Chem. 1964, 239, 18) dopo 60 e 150 minuti dall'iniezione. Il 2,3-DPG (µmoli/ml sangue) è passato da 3.991±0.477 a 3.830±0.703 dopo 60 minuti a 3.183±0.809 dopo 150 min.

Negli animali controllo si è rilevata una corrispondente diminuzione da 3.805±0.163 a 3.542±0.184 dopo 60 minuti a 3.305±0.208 dopo 150 minuti. Le variazioni rilevate non sono significative per cui occorre concludere che la quantità di MLT non è stata sufficiente, o necessita di un tempo più lungo per agire o agisce diversamente.

Se il contenuto in 2,3-DPG si riferisce a 1 globulo rosso, tende a calare dopo trattamento con MLT. La differenza ha una modesta significatività dopo 60 min., buona dopo 150 minuti (0.01

La diminuzione del 2,3-DPG dopo 150 minuti dal trattamento con MLT potrebbe spiegare o contribuire a spiegare la maggiore ossigenazione rilevata nell'uomo dopo il trattamento stesso.

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Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

Luigi Di Bella, M.T. Rossi, L. Gualano, G. Scalera (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale dell'Università di Modena)

Ulteriore contributo al meccanismo di produzione delle variazioni del 2,3-DPG intraeritrocitario dopo trattamento con melatonina (MLT).

L'esochinase e la piruvatochinase sono inibite da un aumento della concentrazione del 2,3-DPG, per cui sono ridotti il consumo di glucoso e la produzione di lattato.

D'altra parte l'aumento del 2,3-DPG fa abbassare il pH intracellulare, e la glicolisi nella misura del 50%, essendo la membrana cellulare impermeabile all'anione del 2,3-DPG.

Poichè il consumo del glucoso viene accelerato, e quello del lattato cresce del 20-30% quando gli eritrociti calano di volume del 30%, intanto che aumenta la concentrazione di ATP e di fosfati inorganici, ma non di 2,3-DPG, abbiamo cercato eventuali variazioni di volume degli eritrociti negli animali trattati con MLT. Il MCV è passato da 54,68±1,18 (prima), a 56,48±0,98, dopo 60 min., a 53,03±0,24 dopo 150 min. negli animali trattati con MLT; da 58,36±0,63, a 60,87±1,09 dopo 60 min., a 61,28±0,48 dopo 150 min. nei controlli.

Le variazioni sono state significative dopo 150 min. nei ratti controllo, negli animali iniettati con MLT, ma non tra animali trattati e quelli controllo. Il contenuto in 2,3-DPG riferito al MCV è stato di 75,471±17,952 prima, di 71,373±18,105 dopo 60 min. e di 60,237±15,996 dopo 150 min. negli animali trattati con MLT; di 65,528±4,170 prima, di 59,739±11,968 dopo 60 min. e di 54,352±7,5 dopo 150 min. nei controlli.

La variazione dopo 150 min. è significativa sia nei ratti trattati con MLT che in quelli controllo ma non tra i trattati e quelli controllo. Riferito alla quantità di Hb, il 2,3-DPG si è mantenuto in rapporti molecolari superiori a 1 in tutti i ratti e nessuna differenza è stata significativa. Si può concludere che la MLT induce variazioni significative soltanto nel contenuto in DPG per G.R., indipendentemente dal MCV, e dalla concentrazione in Hb.

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Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

Luigi Di Bella M.T. Rossi, G. Scalera e G. Tarozzi (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale, Università di Modena)

Rilievi fisiologici ed effetti della melatonina (MLT) sulle talassemie.

Da circa 2 anni abbiamo in corso una vasta sperimentazione in tutta la penisola sulle forme di Talassemia major e minor nei confronti della reazione subbiettiva, obbiettiva e laboratoristica alla somministrazione di MLT.

La quantità somministrata è stata di 1-2 mg/die generalmente a digiuno, e i risultati sono stati relativamente costanti e in alcuni casi affatto brillanti.

Colpiscono obbiettivamente: 1) il cambiamento del colore da giallo pallido a roseo della cute e delle mucose visibili; 2) l'aumento della vivacità; 3) la scomparsa dell'astenia; 4) la scomparsa della facile dispnea da sforzo.

Dal punto di vista obbiettivo i miglioramenti si possono documentare con:a) un aumento dell'intervallo tra una trasfusione e l'altra, uguale rimanendo la quantità di sangue trasfuso ogni volta e i criteri ispiratori della trasfuzione (tasso emoglobinico inferiore a g. 7%; n° di eritrociti inferiore a 3 milioni/mm3; valore ematocritico inferiore a 24); b) i più elevati valori di Hb, di N° di globuli rossi, di valore ematocritico a riscontro periodico.

In qualche caso di Talassemia major splenctomizzato si è arrivati addirittura alla sospensione delle trasfusioni da un periodo che dura ormai da circa 2 anni. Non sappiamo ancora come agisce la MLT; possiamo precisare già alcuni aspetti della sua azione. Aumenta infatti notevolmente e significativamente il tasso dei reticolociti, e a volte compare in circolo qualche eritroblasto policromatofilo. Aumenta anche generalmente il tasso piastrinemico ed il numero dei leucociti circolanti, che in un caso, dopo circa un mese dall'inizio della cura intensa, aveva raggiunto e superato i 90mila elementi/mm3 salvo a regredire poco dopo.

In alcuni casi si ha l'impressione che l'effetto sia relativamente fugace, in quanto sembra potersi notare una certa azione di rimbalzo verso i valori bassi iniziali. È inutile dire che qualora l'ipossia anemica sia responsabile del rallentato sviluppo psichico e somatico, che l'uno e l'altro traggono notevole giovamento dalla somministrazione di MLT.

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Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

M.T. Rossi, G. Scalera, Luigi Di Bella (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale dell'Università di Modena)

Azione mielotropa della melatonina (MLT).

L'azione favorevole nella talassemia della MLT non appare giustificata nè dalle variazioni del 2,3-DPG eritrocitario nè da altre modificazioni del sangue periferico.

Abbiamo perciò studiato i mielogrammi dopo 150 min. dall'iniezione endovena di melatonina nel ratto. Le letture venivano eseguite in campi randomizzati e le percentuali calcolate su almeno 700 elementi per striscio. Gli elementi della serie mieloide dal 46,65±4,36 dopo MLT sono passati al 49,86±6,34 nei ratti controllo; la differenza è significativa (0,05

Gli elementi della serie eritroide sono passati dal 23,24±5,88 dopo MLT al 24,94±2,79 nei controlli; la differenza non è significativa (0,20

Neanche i megacariociti subiscono variazioni significative. La serie linfoide cala significativamente (P<0,025) nei controlli da 28,88±5,46 a 24,85±6,29. Una diminuzione dopo 150 min. dal trattamento con MLT potrebbe essere espressione o di accellerata immissione in circolo, o di ritardata maturazione.

La non significativa variazione della serie eritriode e megacariocitica potrebbe essere espressione o di una mancata incidenza della MLT, o di una influenza qualitativa, o della necessità di un intervallo di tempo più lungo. La diminuzione degli elementi della serie mieloide, bilanciata dall'aumento della serie linfoide, potrebbero accompagnarsi a variazioni inverse nel sangue circolante. In effetti i neutrofili aumentano nel sangue periferico dopo MLT di più che negli animali controllo mentre i linfociti calano.

La migliore ossigenazione dei tessuti dopo somministrazione di MLT ha probabilmente cause molteplici.

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Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

G. Scalera, Luigi Di Bella e M.T. Rossi (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale, Università di Modena)

Influenza di cataboliti azotati normali sul sangue e midollo. Effetto dell'acido urico.

L'acido urico si trova negli eritrociti normali (FOLIN & SVEDBERG: J. Biol. Chem., 1930, 88, 715); il suo trasporto è concentrazione-dipendente, il Q10 è 2.21, l'energia d'attivazione di circa 15800 Cal/mole (LASSEN: Biochem. Biophys. Acta, 1961, 53, 557); il trasporto è fortemente inibito dall'ipoxantina (Idem: Ibidem, 1962, 57, 111) e da altri derivati della purina (Idem: Ibidem, 1962, 57118 e 123).

Non ci è sembrato perciò privo di interesse uno studio sugli effetti dell'ac. urico sopra il sangue ed il midollo. L'infusione e.v. di ac. urico (soluzione satura acquosa a pH 9.41±1.81, a 22°C; ml 3.42 a velocità costante in 171 minuti a ratti del peso di g. 339±83.9) ha fatto calare le plasmaproteine da 5.22±0.25 a 4.406±0.24 (0.01

Data la scarsa solubilità dell'ac. urico in acqua (mg. 5.5% a 22° C) un'altra serie di 6 ratti del di 247.83±13.26 si perfuse con soluzione 1% (p/v) ac. urico in Li2CO3 0.4% (pH 8.57±0.85; 196.5 mOsm). ml 3.39 (=mg. 33.9) in 170 min., e una serie di ratti controllo perfusa con sola soluzione di Li2CO3 0.4%.

Nel sangue periferico, ad eccezione dei neutrofili, che salirono, tutti gli altri dati (eritrociti, piastrine, linfociti, Hb, ematocrito, pres. Osmotica) calarono sia con soluzione di ac. urico+Li2CO3 che con Li2CO3. Le Differenze tra i risultati delle 2 infusioni furono scarsamente significative solo per alcuni dati (% neutrofili, Hb). Nel mielogramma le principali differenze si rilevarono al confronto fra Li2CO3 e soluzione di ac.urico+Li2CO3.

Sono significative infatti sia la serie monocitica, sia le plasmacellule, sia la serie eritroide, sia il rapporto Miel/Er. Le variazioni nel sangue periferico provocate dal Li2CO3 oscurano quelle contemporanee condizionate dall'ac. urico. Non altrettanto può dirsi per le ripercussioni sul midollo. Non è improbabile che anche l'ac. urico si possa riguardare sotto una luce diversa nei confronti di alcune categorie cellulari del midollo.

28)

Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

M.T. Rossi, Luigi Di Bella e G. Scalera

(Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale, Modena)

Influenza di alcuni cataboliti azotati nella funzione del midollo. Effetto dell'urea.

Fra i normali cataboliti azotati l'urea è dei più diffusibili ed ubiquitari e non è forse questa una delle ultime ragioni dell'orientamento verso derivati dell'urea della ricerca di prodotti ad attività antiblastica (MOHLER: Canc. Chemotherapy Rep., 1964, 341; STEARNS et alii: J. Med. Chem., 1963, 6, 201).

D'altra parte l'eritropoiesi si modifica nell'insufficienza renale (ADAMSON e Coll.: Amer. J. Med., 1968,44, 725; ESCHBACH e Coll.: New Engl. J. Med., 1967, 276, 653; NATHAN e Coll.: Ann. N.Y. Acad. Sci., 1968, 149, 539).

Abbiamo ritenuto, anche per i predetti motivi, giustificato uno studio sistematico degli effetti della perfusione d'urea sul sangue e sul midollo. Ratti maschi del peso di g. 375±37.7 sono stati perfusi con soluzione acquosa 1M d'urea per ca. 150 min., ed altri del peso di g. 411±51.16 sono stati perfusi con sol. 5M d'urea per oltre 3 hr. Nè il n° degli eritrociti nè il valore ematocritico, nè il no. dei leucociti sono cambiati significativamente nel sangue periferico.

La %le dei neutrofili è salita mentre quella dei linfociti è calata significativamente nei 2 gruppi di ratti, che fossero stati perfusi con soluzione 1M o 5M d'urea. Le piastrine non mutano dopo perfusione con urea 5M, mentre calano (P<0.001) con urea 1M. Nè l'Hb, nè le proteine plasmatiche, nè la pressione osmotica del sangue, nè quella del midollo, nè la pres. osmotica del plasma dei ratti perfusi con soluzione 1m di urea cambiano significativamente; aumenta solo (0.05

Nel midollo la serie mieloide aumenta (0.1

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Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

M.T. Rossi, Luigi Di Bella, G. Tarozzi e G. Scalera (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale dell'Università di Modena)

Influenza dei plasma expander sulla cellularità del midollo.

L'effetto dei plasma expander non si limita alla diluizione del sangue, ma si estende a numerosi altri aspetti (A. Segal: The clinical use of dextran solutions. Grune e Stratton, 1964, N.Y.). Noi abbiamo qui ricercato l'influenza di soluzioni acquose di destrano (Dx: p.m. 70.000; 188,6±7,3 m. Osm.) e di polivinilpirrolidone (PVP; p.m. 10.000; 246,66±13,6 m.Osm.) sulla cellularità del midollo osseo di femore e di tibia di ratti del peso di g 350±93 per il Dx; di 356±46 per il PVP, perfusi in narcosi nembutalica con le soluzioni acquose dei due plasma expander, alla velocità costante di infusione di ml 1,2/h, per tempi da 50 a 250 min. per il Dx; da 35 a 210 min. per il PVP.

La cellularità del midollo non sembra dipendere dalla durata della perfusione, nè dalla quantità complessiva di colloide artificiale infuso, ciò che stava ad indicare essere essa indipendente, entro i limiti degli esperimenti qui condotti, dalle modeste variazioni della pressione colloido-osmotica del sangue circolante, che furono, alla fine degli esperimenti, di m.Osm. (%) 2,85±2,25 per il plasma, di 1,99±1,85 per il sangue intero dopo infusione di PVP; -5,712±22,64 per il plasma, -1,532±9,50 per il sangue intero dopo infusione con Dx.

Se si prescinde dalla durata di perfusione e dalla quantità complessiva di plasma expander infuso, il numero totale di cellule del midollo per mm3 di midollo è stato trovato di 1598x103618X103 dopo infusione di Dx, di 1663x103±701x103 dopo infusione di PVP: fra le due medie la differenza non ha nessuna significatività.

Si può concludere che eventuali modificazioni nel numero e nella distribuzione tra i vari tipi cellulari nel sangue periferico dopo infusione di plasma expander non debbono di necessità originarsi da interferenze col midollo. Esse possono verisimilmente anche originarsi da varie azioni nella distribuzione dei rapporti di velocità tra la corrente marginata e quella assiale, nonchè da altri fattori periferici.

30)

Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

G. Scalera, M.T. Rossi, Luigi Di Bella e G. Bursi (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale, Università di Modena)

La pressione osmotica del midollo osseo dopo perfusione con plasma expander.

Constatazioni sperimentali concordano nel suggerire l'importanza per la maturazione, la migrazione nei successivi compartimenti midollari (McCULLOCH e Coll.: Biochim. Biophys. Acta, 1974, 355, 260) la trasmigrazione nei sinusoidi dell'acqua, non molto diversamente che nella midollare del rene di mammiferi (HARGITAY & KUHN: J. Elektrochem., 1951, 55, 539).

Nel flusso dell'acqua per i vari spazi midollari si innesterebbero i processi di maturazione, progressione, trasmigrazione degli elementi parenchimali del midollo. Abbiamo seguito le variazioni della pressione osmotica (p.o.) del midollo dopo perfusione e.v. di colloidi artificiali come destrano e polivinilpirrolidone (PVP).

Il midollo l'abbiamo prelevato alla fine della perfusione e.v. dei due colloidi. Alcuni midolli furono centrifugati alla temp. di 0°C±2°C, alla velocità di 20000 rpm, per separare il liquido intercellulare - sopranatante dalle cellule parenchimali del sedimento. La p.o. del midollo intero è risultata preticamente indipendente dalla durata della perfusione, e dalla quantità assoluta e relativa di colloide infuso, che questo sia destrano o PVP.

La p.o. trovata è stata in media di 465.33±52.316 nei midolli di ratti perfusi con destrano; di mOsm. 422.66±55 nei midolli di ratti perfusi con PVP per tempi di perfusione da 50 a 70 minuti col primo, da 167.5 a 210 minuti col PVP. Il midollo del radio dopo perfusione (da 50 a 280 minuti ha nell'80% dei casi una p.o. più alta di quella della tibia e nel 100% dei casi più alta di quella del femore.

Si può concludere che i colloidi artificiali non sono in grado di fare aumentare la p.o. del midollo; che non tutti i midolli delle ossa lunghe si comportano in ugual maniera; che quello dell'omero tende ad avere i valori più alti.

31)

Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

G. Tarozzi, G. Scalera, M.T. Rossi, Luigi Di Bella (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale dell'Università di Modena).

Meccanismi di regolazione della pressione osmotica e funzione del midollo.

L'attività riproduttiva degli elementi del midollo mantiene costante la costituzione cellulare del sangue, col quale debbono quindi intercorrere rapporti di omeostasi "feedd-back", riguardanti l'attività riproduttiva, la migrazione, la trasmigrazione dentro i sinusoidi.

In tutti questi processi il ricambio dell'acqua potrebbe avere importanza rilevante. Il midollo intero ha un abbassamento crioscopico minore di quello del sopranatante acellulare, probabilmente perchè il contratto con il termistore avviene solo in parte col liquido intercellulare, e in parte con la membrana degli elementi parenchimali, il cui citoplasma non era ancora congelato.

Perciò la pressione osmotica del liquido intercellulare è stata in media di 1,792 volte superiore a quella del midollo; il coefficente ha ovviamente significato e valore costante qualora la celularità del midollo, la costituzione e i caratteri fisici delle sue cellule rimangano costanti.

La pressione osmotica del midollo (Osm) sarebbe legata a quella del sopranatante (Oss) dalla relazione (1): Osm=k.Oss in cui k=0,556. Se la cellularità del midollo cambiasse la relazione (1) diventerebbe:

Osm=f(Nm).Oss(r), in cui f(Nm) è una funzione del nupmero delle cellule per mm3 di midollo. Dopo infusione e.v. di Dx e PVP la osmolarità del midollo dell'omero aumenta di circa 27 m.Osm./h, nella tibia di 13,8 m.Osm/h, nel femore di 1,26 m.Osm/h, praticamente cioè rimane costante.

Poichè la cellularità è più bassa nel midollo dell'omero, ma nel midollo del femore uguale a quella della tibia, non si può senz'altro affermare che la pressione osmotica varia nel tempo, dopo infusione e.v. di plasma expander, in funzione inversa alla cellularità del midollo. Anche se i plasma expander non sono in grado di modificare la pressione osmotica del midollo osseo subito dopo la fine della infusione, essi tuttavia inducono modificazioni sull'aumento lineare successivo in vitro.

32)

Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LII, N.18 bis - 30 ottobre 1976

Luigi Di Bella, G. Scalera, M.T. Rossi, G. Tarozzi (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale dell'Università di Modena)

Il mielogramma dopo infusione di plasma expander.

Midolli di tibia e femore (l'omero è molto povero di midollo) si sono raccolti in pesa-filtri comuni e rapidamente mescolati con bacchetta di vetro smussa; la poltiglia è stata strisciata e i vetrini allestiti e letti.

I ratti, in narcosi nembutalica erano stati perfusi per intervalli variabili, da 35 a 210 min., e a velocità costante, con soluzione acquosa di destrano e PVP; alla fine della infusione erano stati il più possibile completamente dissanguati e il midollo enucleato dalle ossa lunghe dopo essere state fissate in una morsa e segate per il lungo.

Le letture eseguite su 54 vetrini di 19 ratti, di cui 14 perfusi e 5 controllo, su almeno 700 elementi per vetrino, sono state alquanto uniformi. Nè i mastociti, nè i megacariociti cambiano nei due gruppi. I moniciti, la serie mieloide e le plasmacellule sembrano invece più riccamente rappresentate negli animali perfusi che nei controlli, mentre i linfociti e gli eritrociti sono rappresentati in minor percentuale nei ratti perfusi.

Se la diminuzione della percentuale di una serie fosse dipendente dalla più veloce migrazione verso il sangue, e se gli elementi rimanessero nel sangue per tutta la durata dell'esperimento si dovrebbe avere una linfocitosi ed eritrocitosi non confermata dai risultati sperimentali.

Probabilmente l'aumento è diluito ed anche invertito dall'aumento di volume del plasma. L'aumento della percentuale delle plasmacellule potrebbe spiegare l'aumento delle plasmaproteine in circolo. Nella perfusione con destrano le proteine sono cresciute nella metà dei ratti, in media del 42% e sono calate, nell'altra metà in media del 18%. Nella perfusione con PVP le proteine in circolo sono calate in 7 su 8 ratti.

Non basta ovviamente l'aumento della percentuale delle plasmacellule nel midollo per giustificare l'aumento delle plasmaproteine; diversità di comportamento esistono anche nei confronti della natura dell'agente responsabile dell'avvenuto aumento.
 

33)

SYMPOSIUM ON REGULATION OF PITUITARY FUNCTIONS. Abstracts of papers - Strbské Pleso, October 13-15, 1976.

Luigi Di Bella, G. Scalera, M.T. Rossi

(Institute of Human Physiology, University of Modena, Italy)

Mutual relations between thymus and hypophysis.

Thymus was partially (14,4%) or totally removed from both male and female Wistar adult rats, and hypophYsis was removed after 18-19 days from complete or incomplete thymectomy.

Its weight was found to be significantly higher in thymectomized than in sham-thymectomized female rats; the higher weight of hypophysis is accounted for by an higher water content.

The GH content of thymectomized adult male rats hypophysis is as high at that of sham-thymectomized adult male rats; it has been found on the contrary to be higher in thymectomized than in sham-thymectomized adult female rats.

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SYMPOSIUM ON REGULATION OF PITUITARY FUNCTIONS. Abstracts of papers - Strbské Pleso, October 13-15, 1976.

M.T. Rossi, G. Scalera, Luigi Di Bella

(Institute of Human Physiology, University of Modena, Italy).

Do enterogen mechanoceptive impulses contribute to liberation of GH from adenohypophysis?

The lasting enlargement of rat bowel by indigestible cellulose foods, as tested, among others, by plentiful tender stools, is followed by a significant increase in GH content of rat pituitary, as tested either by tail relative lengthening, or by body weight gain, when rats were injected i.p. with corresponding doses of suspended aceton dried hypophysis powder.

The impulses from bowel reach probably anterior hypophysis or even hypothalamus by partly at least travelling along paravertebral sympathetic chain and periarterial (carotid a./or vertebral aa.) plexuses, as suggested among others by the significant increase in pituitary GH content, following 15 min lasting electrical stimulation of paravertebral sympathetic chain (Th. IV-X; Ag-AgC1 electrodes; square waves 40Hz 10 Volts).

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The 16^th International Congress of Hematology - September 5-11 - Kyoto - Japan

Abstracts free communications and scientific exhibitions.

Luigi Di Bella, M.T. Rossi and G. Scalera (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale, Istituti Biologici, Modena, Italy).

Physiological Basis for a Rational Therapy of Bone Marrow Diseases.

The reproduction, differentiation and release of blood cells from bone marrow seem to be governed by metabolic products, by water displacement from cellular to intercellular compartment, by neuro-hormonal agents, by poietin formation and activation. Urea and uric acid increase the bone marrow density distribution, and probably accelerate maturation of granulocytes. Bone marrow extracellular normal hyperosmolar fluid seems to play a role in mitogenesis and differentiation of bone marrow cells. Some leukemic patients suffer nocturnal diuresis due to a probable biorhythmic deficiency of dispensable adiuretin, during a leukaemia relapse. Cell water content probably reduces during maturation as a consequence of organic phosphate compounds accumulation, of intracellular pH despression, of ATP, GTP, and other nucleotides polymerization in dense bodies, under the influence of hormones and neural transmitters, like nor-adrenalin, 5-OH-tryptamin, dopamine and 5-OH-dopamin.

Melatonin (MLT), however, seems to play a dominant role, insamuch as:

a) habenular nuclei stimulation induces thrombocitosis;

b) i.v., injected MLT induces blood platelet rise in thrombocytopenic patients; and

c) systematic oral or parenteral administration of MLT induces a seemingly healing state from acute or cronic lymphocytic leukemia.

MSH and ACTH, or shorter corresponding polypeptide chains, seem to play as much an important role for a normal bone marrow function as MLT.

The aforesaid factors validly contribute to effectuate the formation and activation of erythro-thrombo, and leukopoietins. The relative trouble reveals through a decrease of red blood cells and platelet blood count, as well as with a rise of eosinophil cell blood count.

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Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LIII, N.18 bis - 30 ottobre 1977

Luigi Di Bella, L Gualano, M.T. Rossi e G. Scalera (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale dell'Università di Modena)

Effetti della somatostatina sulla funzione midollo osseo.

La Somatostatina (ERAZEAU & Coll.: Science, 1973, 179, 77) non esercita apparenti ripercussioni sulle piastrine nell'uomo (MIELKE e Coll.: New Engl. J. Med. 1975, 293, 480) neanche in pazienti diabetici con probabile aumento del GH nel sangue (TUTWILER G.T.: Aca Diabet. Lat. 1976, 13, 177), mentre può indurre diatesi emorragica nei babbuini (KOERKER & Coll.: New Engl. J. Med. 1975, 293, 476).

Poichè la somatostatina sembra esercitare effetti bloccanti sulla crescita di elementi neoplastici, abbiamo voluto provare se nei ratti esercitasse uguali effetti sugli elementi del midollo osseo. Dosi da 50 a 200 µgKg-1.d-1 non abbassano il n° dei GR nè il tasso di Hb, mentre mg 1·Kg-1·d-1 fanno abbassare entrambi. Non subiscono modificazioni il n° dei globuli bianchi e piastrine e neanche il tasso protidemico. Il solvente (protamina+ZnClg) fa calare il n° dei leucociti circolanti, mentre fa aumentare il tasso protidemico, con quale meccanismo è difficile precisare (v. letteratura in: VALLEE, D.L.: Physiol. Rev. 1959, 39, 443: FRIEDRICKS & Coll.: J. Clin. Invest. 1964, 43, 304).

Rispetto ai controlli sono riuscite significative le variazioni %ali del tasso protidemico di tutti i ratti iniettati con SRIF, le variazioni %li del n° di GR e del tasso Hbco in alcuni gruppi soltanto. Nel mielogramma non si sono rilevati spostamenti delle serie mieloide, eritroide, linfoide e megacariocitica. In fettine di midollo di 3µ (Zenker-paraffina-May-Grünwald-Giemsa) la densità dei megacariociti sembra più bassa nei ratti trattati con dosi minori di SRIF, mentre il n° degli elementi cellulari del midollo e la formula leucocitaria non subiscono spostamenti significativi.

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Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LIII, N.18 bis - 30 ottobre 1977

L. Gualano, Luigi Di Bella, M.T. Rossi e G. Scalera (Istituto di Fisiologia Umana, Cattedra di Fisiologia Generale dell'Università di Modena)

Effetti della melatonina sui megacariociti viventi di midollo di ratto.

La maturazione in vitro dei megacariociti è stata seguita da THIERY & BESSIS (C.R. Acad. Sci., 1956, 242, 290) su cellule viventi e da PAULUS (Exp. Cell. Res. 1967, 48, 27) su sospensioni di midollo osseo. Dato il significato che per la piastrinopoiesi assume la melatonina (MLT) ci è sembrato utile seguire la reazione dei megacariociti alla MLT in vitro. Abbiamo fatto ricorso ad una tecnica simile a quella elaborata da ROSE (Cinemicrography in Cell Biology, 1963, N.Y., Acad. Press) e MUNRO (Exp. Cell. Res. 1963, 32, 408) adoperando un fotomicroscopio Zeiss III, con camera fotografica integrata, ad esposizione automatica e obiettivi planacromatici 63/1,4 e 100/1,25 ad immersione in olio, e pellicole a 12 Din, con interposizione di filtro verde con * max.=551 nm.

Le cellule di midollo veniva sospese in soluzione salina, isoionica, glucosata, tamponata a pH 6,7-6,8 con  crioscopico corrispondente a 370-380 mOsm, scaldata a 37°C, ossigenata. La camera di osservazione era formata da due vetrini coprioggetto, tenuti distanti 1,5 mm da un tubo di teflon di 1,5 mm di diametro esterno che portava l'O2. La camera consentiva l'osservazione di megacariociti vitali anche per 8 ore. La MLT si faceva arrivare nella sospensione a mezzo di un tubicino di teflon di 1,5 mm di diametro esterno, connesso con una microsiringa. Sia l'emissione e la retrazione di pseudopodi, che l'indentazione della membrana, sia l'emissione che la formazione delle piastrine sembrano essere influenzate dalla MLT.

Rimane da stabilire se l'effetto è dose dipendente, in quale misura dipende dal grado di maturazione dei megacariociti, se è specifico. Il metodo sembra comunque prestarsi bene allo studio dell'attività di cellule viventi in vitro.

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Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LIV, N.18 bis - 30 settembre 1978

L. Gualano, Luigi Di Bella, M.T. Rossi, G. Scalera

(Istituto di Fisiologia Umana dell'Università di Modena)

Aspetti funzionali dei megacariociti in vitro.

L'osservazione che portò WRIGHT (J. Morph., 1910, 21, 263) a postulare l'ipotesi dell'origine megacariocitica delle piastrine fu fatta su megacariociti in vitro, e su preparati istologici di midollo. Essa venne confermata e precisata da THIERY & BESSIS (Rev. Hémat., 1956, 11, 162), che rilevarono violenti movimenti di allungamento e retrazione di processi citoplasmatici nei megac. granulosi e da KINOSITA & OHNO (Bibl. Anat., 1961, 1, 106) nel midollo di coniglio.

Espansioni citoplasmatiche, fra le altre cellule di midollo o dentro i sinusoidi, furono viste da BEHNKE (J. Ultrastruct. Res., 1969, 26, 111) nei megac. granulosi; esse perdevano poi le connessioni con la cellula madre e si risolvevano in piastrine. Identici fenomeni furono visti da KEYSERLINGK & ALBRECHT (Z. Zellforsch., 1968, 89, 320). Le piastrine si formerebbero per coalescenza del "Demarcation Membrane System" (BEHNKE: J. Ultrastr. Res., 1968, 24, 412).

In una sospensione recente di midollo di femore di ratto in liquido nutritivo, isotonico, isoionico, isoidrico, glucosato, termostatato a 37°C, ossigenato e costantemente rinnovato per perfusione continua, i megac. sopravviventi non hanno mai presentato movimenti di membrana o di granuli citoplasmatici, o comunque altre modificazioni, ad eccezione di movimenti oscillanti di granuli isolati, di cui alcuni extracellulari. Ciò concorda con l'osservazione di PULVERTAFT (J. Clin. Pathol., 1958, 11, 535) che non rilevò mai fenomeni interpretabili come piastrinogenesi in vitro, mentre contrasta con quelli di PISCIOTTA & Coll. (Blood, 1953, 8, 703) e IZAK & Coll. (Blood, 1957, 12, 507 e 520) che hanno adoperato tecniche in parte diverse.

Il contrasto sembra dipendere dall'O2, nonchè da fattori umorali (trombocitopoietina) normalmente circolanti nel sangue.

Megacariociti, piastrinogenesi, trombocitopoietina.

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 Bollettino della Società Italiana di Biologia Sperimentale - Vol. LIV, N.18 bis - 30 settembre 1978

Luigi Di Bella, L. Gualano, M.T. Rossi, G. Scalera

(Istituto di Fisiologia Umana dell'Università di Modena)

Sul meccanismo della piastrinogenesi in vitro.

Dopo induzione di trombocitopenia cresce la produzione di piastrine nel midollo (CRADDOCK & Coll.: J. Lab. Clin. Med. 1955, 45, 906) mentre cala nella trombocitosi (CRONKITE: Homeostatic Mechanisms, 1957, Brookhaven. Nat. Lab., Upton N.Y.). Questa regolazione a feed-back positivo sarebbe dovuta ad un fattore umorale (YAMAMOTO: Acta Haemat. Jap., 1957, 60, 163), chiamato trombocitopoietina da KELEMEN & Coll. (Acta Halmat. Basel, 1958, 20, 350).

Poichè la stimolazione dei gangli delle abenule produce trombocitosi (Di Bella & Coll., Boll. SIBS, 1969, XLV, com.ne n° 171), e la melatonina è il principale composto indolico epitalamico (LERNER & Coll., J.A.C.S., 1958, 80, 2587), e si distribuisce in tutti i liquidi e tessuti dell'organismo (REITER: The pineal, 1977, Eden Press) si dovrebbe tentare di identificare la melatonina con la trombocitopoietina.

In effetti la melatonina provoca in vitro: 1) l'aumento delle granulosità del citoplasma dei megacariociti di midollo di ratto; 2) aumento della velocità di rotazione e traslazione dei granuli intra- ed extracellulari; 3) comparsa di protrusioni citoplasmatiche; 4) fuoriuscita di granuli simili a piastrine. Detti fenomeni sono più accentuati nei megacariociti granulosi. La melatonina non ha effetti apparenti sul nucleo.

Queste constatazioni sperimentali possono conciliarsi con l'ipotesi di una identificazione della melatonina con la trombocitopoietina; esse vanno ovviamente integrate da altre relative a precisare il carrier plasmatico, i meccanismi di dissociazione dello stesso, etc.

Megacariociti, melatonina, piastrine, trombocitopoietina.